第一节 细胞衰老

一、细胞衰老的概念

  • 名词解释：随着时间的推移，细胞的增殖能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。衰老的细胞呈现出一种不可逆的生长停滞状态，其最终结果将导致细胞死亡。

（一）细胞衰老与机体的衰老既有区别又有联系

1、个别细胞、甚至机体局部许多细胞的衰老与死亡并不影响细胞的寿命；同样，机体衰老并不代表所有细胞的衰老。

2、机体衰老是以细胞总体的衰老为基础的，细胞总体的衰老反映了机体的衰老。

（二）机体内各类细胞的寿命不同

除干细胞外，根据寿命情况将细胞分为三类：第一类细胞的寿命接近于动物的整体寿命，如B；第二类是缓慢更新的细胞，其寿命比机体的寿命短，如C；第三类是快速更新且寿命较短的细胞，如A。
A. 皮肤的表皮细胞、红细胞和白细胞等
B. 神经元、脂肪细胞、肌细胞等
C. 肝细胞、胃壁细胞等

（三）细胞在体外培养条件下的寿命

Hayflick界限：1961年，Hayflick首次报道了体外培养的人成纤维细胞具有增殖分裂的极限，即Hayflick界限。动物体在体外可传代的次数，与物种的寿命有关。同时，细胞分裂能力与个体的年龄有关。

二、细胞衰老的表现

（一）细胞衰老的形态变化

  • 衰老细胞的形态变化主要表现在细胞皱缩、膜通透性和脆性增加、核膜内陷和细胞器数量减少，特别是线粒体数量减少，胞内出现脂褐素等异常物质沉积，最终出现细胞凋亡或坏死。

（二）细胞衰老过程中有生物大分子和代谢的改变

（习题集·三·1）细胞衰老过程中有生物大分子和代谢的改变有哪些？
（1）DNA：复制与转录受到抑制，但也有个别个体会异常激活，端粒DNA丢失，线粒体DNA特异性缺失，DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度降低。
（2）RNA：mRNA和tRNA含量降低
（3）蛋白质：含量下降，细胞内蛋白质发生糖基化、氨甲酰化、脱氨基等修饰反应，导致蛋白质的稳定性、抗原性和可降解性降低，自由基使蛋白质肽键断裂，交联而变性。氨基酸由左旋变为右旋。
（4）酶分子：活性中心被氧化，金属离子Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+等丢失，酶分子的二级结构、溶解度和等电点发生改变，总的效应就是酶失活；但β-半乳糖苷酶（SA-βgal）活性增强。
（5）脂类：不饱和脂肪酸被氧化，引起膜脂之间或与脂蛋白之间交联，膜的流动性降低。

三、衰老细胞的学说和机制

（一）有许多学说诠释细胞衰老过程

1、遗传决定学说认为衰老是遗传上的程序化过程

（1）内容：该学说认为衰老是遗传上的程序化过程，其推动力和决定因素是遗传的基因组；控制生长发育和衰老的基因都在特定时期有序地开启和关闭。

（2）举例：①早老衰综合症：患儿很早就出现明显衰老症状，12~18岁即夭折。（核纤层蛋白A基因突变，常染色体隐性遗传病）
②成人早衰症：平均39岁时出现衰老，47岁左右生命结束。（引起该病的基因与DNA的解旋有关，患者的DNA不能够自我修复）。

（3）衰老基因：在细胞衰老时，其表达水平显著高于年轻细胞，可使永生化细胞逆转而衰老，其丢失或激活可引起细胞永生化。如MORF4基因、p16基因。

（4）抗衰老基因（长寿基因）：
①延长因子-1α（EF-1α）基因；
②酵母中sgs1基因编码产物是DNA解旋酶，人8号染色体上的WRN基因与之同源；
③Klotho基因和SIRT1基因。

2、自由基学说认为活性氧基团导致细胞损伤和衰老

（1）自由基：自由基是指那些在原子核外层轨道上具有不成对电子的分子或原子基团。

（2）在正常情况下，人体内自由基的产生有两方面：一是环境中的高温、辐射、光解、化学物质等引起的外源性自由基；二是体内各种代谢反应产生的内源性自由基。

（3）自由基的危害：

①使质膜中的不饱和脂肪酸氧化，从而使膜内酶活性破坏，膜蛋白变性、膜脆性增加、膜结构发生改变，因而膜的运输功能紊乱以致丧失。

②将蛋白质中的疏基氧化而造成蛋白质发生交联、变性，使酶失活。

③使DNA链断裂、交联、碱基羟基化、碱基切除等，从而对DNA造成损伤。

3、端粒钟学说认为端粒随细胞分裂不断缩短为衰老的主要原因

（1）端粒钟学说的内容：端粒钟学说认为，正常情况下，随着细胞的不断分裂，染色体末端的特殊结构“端粒”会逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度时，细胞增殖停滞，发生细胞衰老。

（2）复制性衰老（名词解释）：随着细胞分裂而端粒缩短，从而诱发的细胞衰老，即与端粒和端粒酶直接相关的衰老。

（3）早熟性衰老：早熟性衰老是指氧化应激诱导的非端粒依赖性衰老。

4、细胞代谢废物累积可引起细胞衰老

（1）代谢废物累积学说：由于细胞功能下降，一方面细胞不能将代谢废物及时排出胞外，另一方面又不能将其降解与消化，这样代谢废物越积越多，在细胞中占据的空间越来越大，影响细胞代谢废物的运输，以致阻碍了细胞的正常生理功能，最终引起细胞的衰老。

（2）在老年性痴呆患者脑组织中有大量β-淀粉样蛋白沉积，而β-淀粉样蛋白可作为老年性痴呆的鉴定指标。

5、基因转录或翻译差错导致细胞衰老

  • 内容：随着年龄的增长，机体的细胞内不但DNA复制效率下降，而且常会发生核酸、蛋白质、酶等大分子的合成差错，这种逐渐累积的差错最终引起细胞功能降低，并逐渐导致细胞衰老、死亡。

6、其他学说：“神经免疫网络论”“钙调蛋白学说”“微量元素学说”等。

（二）复制性细胞衰老和氧化应激诱导的非端粒依赖性细胞衰老的调控

1、细胞衰老过程中，细胞增殖停滞在G1期末。

2、目前认为，主要有两种突进调控细胞的衰老：一条是复制性衰老的调控，它依赖于p53→p21、pRb→E2F信号通路的调控；二是氧化应激诱导的非端粒依赖性细胞衰老，它受ERK→p38MAPK→p16→pRb信号通路的调控。

四、细胞衰老与疾病

第二节 细胞死亡

一、细胞死亡的方式

1、细胞凋亡

（1）名词解释：细胞凋亡指在特定信号诱导下，细胞内的死亡级联反应被触发所致的生理或病理性、主动性的死亡过程。

（2）细胞凋亡时，质膜始终保持完整，胞膜内陷将细胞内容物包被成一些囊状小体，即凋亡小体，后者被周围吞噬细胞吞噬，不引起炎症反应。

2、细胞坏死（名词解释）：细胞坏死指在外来致病因子的作用下，细胞生命活动被强行终止所致的病理性、被动性的死亡过程。

3、细胞焦亡：最近，发现一种新的细胞死亡方式，成为细胞焦亡或细胞炎性坏死，表现为细胞不断胀大直至细胞破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应，是一种程序性细胞坏死。

二、细胞凋亡的概念和特征

（一）细胞凋亡是由死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程

1、程序性细胞死亡（PCD）（名词解释）：在一定时间内，细胞按特定的程序发生死亡，这种细胞死亡具有严格的基因时控性和选择性。

2、细胞凋亡现象普遍存在于人类及多种动、植物中，是多细胞生物体个体正常发育、维持成体组织结构不可缺少的部分，贯穿于生物全部的生命活动中，它是细胞生理性死亡的普遍形式。

（二）细胞凋亡呈现出特征性形态学变化

1、细胞核的变化：凋亡细胞的核DNA在核小体连接处断裂成核小体片段，并向核膜下或中央部异染色质区聚集，浓缩成染色质块，使细胞核呈现新月状、花瓣状等多种形态，染色体进一步聚集使核膜在核膜孔处断裂，形成核碎片或核残片。

2、细胞质的变化：由于脱水作用，凋亡细胞的胞质发生明显浓缩；线粒体增大，嵴增多，接着线粒体出现空泡化；多数情况下。内质网腔增殖膨大，并为凋亡细胞形成的自噬体结构提供包裹膜；凋亡细胞原有的疏松、有序的细胞骨架结构也变得致密、紊乱。

3、细胞膜的变化：凋亡细胞表面原有的特化结构，如微绒毛、细胞突起及细胞间连接等逐渐消失；细胞膜起泡，但细胞膜仍然保持完整；磷脂酰丝氨酸（PS）则从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露于细胞外环境中。

4、凋亡小体的形成：凋亡小体的形成有三种方式：①发芽脱落机制。凋亡细胞内聚集的染色质块，形成大小不等的核碎片后，整个细胞通过发芽、起泡等方式，形成一个球形的突起，并在根部绞窄脱落，形成一些大小不等，内含胞质、细胞器以及核碎片的膜包小体，即凋亡小体；②分隔机制。在凋亡细胞内由内质网分隔成大小不等的分隔区，靠近细胞细胞膜端的分隔膜与细胞膜融合并脱落形成凋亡小体；③自噬体形成机制。凋亡细胞内线粒体、内质网等细胞器核其他胞质成分一起被内质网膜包裹形成自噬体。自噬体在与凋亡细胞膜融合后排出胞外，形成凋亡小体。

（三）细胞凋亡时细胞生化改变的复杂性和多样性

1、DNA片段化（细胞凋亡最典型的生化特征之一）：细胞凋亡时，细胞的内源性核酸内切酶活化，特异地在连接区切断DNA链，形成180bp~200bp整数倍的寡聚核苷酸片段。

2、细胞凋亡中的蛋白酶：

（1）凋亡的起始和进程受多种蛋白酶控制，蛋白酶级联切割可能是凋亡最关键的过程——凋亡机制的核心部分。

（2）控制凋亡的蛋白有多种，如胱天蛋白酶家族、端粒酶家族或分裂素及钙蛋白酶等。

3、胞质Ca2+、pH的变化

（1）Ca2+能通过两种途径诱导细胞凋亡

①胞内Ca2+库释放，胞外Ca2+内流使胞内Ca2+持续升高，作为凋亡信号启动凋亡

②Ca2+的释放打破了细胞内结构的稳定，使细胞凋亡系统的关键系统的关键成分与正常时不能接触到的基质发生反应，从而触发凋亡。

（2）胞质pH跟Ca2+一样，其浓度对生命活动影响重大：胞质碱化和酸化均能影响细胞凋亡。

4、线粒体在细胞凋亡中的作用

线粒体在细胞凋亡中的作用有哪些？

① 线粒体呼吸链受损，能量代谢受到破坏，导致细胞死亡。

② 线粒体释放细胞色素C（cyt C），而cyt C时凋亡所必需的胱天蛋白酶家族的激活物。

③ 线粒体是细胞产生活性氧类物质（ROS）的主要来源，ROS是细胞凋亡的信使分子和效应分子，凋亡时细胞生成更多ROS。

④线粒体渗透转变孔（PT pore）通透性增高，这是凋亡早期的决定性变化。PT孔时线粒体内外膜接触部位协同组成的通道，其开放能导致呼吸链解耦联，cyt C可通过开放的渗透转变孔进入胞质，触发胱天蛋白酶家族的级联反应。（PT孔开放抑制剂，如环孢素，能够阻断细胞凋亡）

（四）失巢凋亡是又一种形式的细胞程序死亡

失巢凋亡（名词解释）：失巢凋亡时因细胞与细胞外基质和其他细胞脱离接触而诱发的，是在脱离原来生存环境的特殊情况下发生的细胞凋亡。

（五）细胞凋亡与细胞坏死的区别

三、细胞凋亡的影响因素

1、细胞凋亡的诱发因素

（1）生理性诱导因子：肿瘤坏死因子（TNF）及其家族中Fas配体（FasL）、转化生长因子β（TGF-β）、神经递质（谷氨酸，多巴胺，N-甲酰-D-天门冬氨酸）、Ca2+、糖皮质激素等。

（2）损伤相关因子：热休克、病毒感染、细菌毒素、原癌基因（如myc、rel，腺病毒E1A等）、抑癌基因（如野生型p53基因）、细胞毒性T淋巴细胞、氧化剂、自由基、缺血、缺氧等。

（3）疾病治疗相关因子：化疗、放疗、生物治疗、中药治疗等。

（4）其他又某些细胞毒性物质：如乙醇、氧化砷、β-淀粉样肽等。

2、细胞凋亡的抑制因素

（1）生理性抑制因子：如bcl-2原癌基因、突变型p53、各种生长因子、细胞外基质、CD40配体、一些中性氨基酸、锌以及雌、雄激素。

（2）病毒基因：如腺病毒E1B、杆状病毒、牛痘病毒crmA、EB病毒BHRF1及LMP-1、单纯疱疹病毒等基因。

（3）其他：线虫的ced-9基因、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、钙蛋白酶抑制因子、促癌剂（如PMA等）。

四、细胞凋亡的分子机制

（一）细胞凋亡受多种基因调控

1、调控细胞凋亡的ced基因和caspase基因家族

（1）研究已发现有15个基因在不同程度上与线虫的细胞凋亡有关，并大致分为四组：

① 第一组基因在线虫的凋亡调控中有重要意义，包含ced-3、ced-4和ced-9基因；

② 第二组包括7个基因，即ced-1、ced-2、ced-5~ced-8以及ced-10，它们与凋亡细胞被吞噬清除过程有关，但与细胞死亡本身无关；

③ 第三组包含核酸酶基因1（nmc-1）,如果nmc1发生突变，则DNA裂解受阻，但并不能抑制细胞死亡，这也表明nmc-1并非凋亡所必需；

④ 第四组是影响特异细胞类型凋亡的基因，包括ces-1、ces-2（ces表示线虫存活的调控基因）以及egl-1和her-1，它们与某些神经元和生殖系统体细胞的凋亡有关。

（2）ced-9能抑制胱天蛋白酶的活化，从而抑制线虫体细胞凋亡的发生，因此也被称为“抗凋亡基因”。

（3）哺乳动物的caspase家族蛋白是ced基因产物的同源体，ced-4的哺乳类同源物直到1997年才被证明是细胞凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）；ced-9与哺乳动物的bcl-2家族具有一定的同源性。

2、既能抑制又能促进细胞凋亡的bcl-2（B细胞淋巴瘤/白血病-2）基因家族

有的成员对凋亡起抑制作用，如bcl-2可防止或延迟γ-辐射、糖皮质激素、热休克和多种化疗药物所诱导的细胞凋亡，故bcl-2基因也被称作“存活基因”；但有的是凋亡的促进者，如bad、bax等。

3、可促进细胞凋亡的ice基因

4、可触发细胞凋亡的Fas和FasL

（1）多种哺乳动物细胞表达Fas，而FasL仅表达于活化的T细胞。

（2）Fas/FasL的重要生理作用表现在：

①触发细胞凋亡。抗Fas抗体、表达FasL的细胞，以及可溶性的FasL与Fas交联后均产生细胞凋亡信息；

②Fas/FasL对免疫系统细胞的死亡起重要作用。以Fas为基础的和以穿孔素为基础的机制，是迄今发现的两种T细胞介导的细胞毒机制；

③Fas/FasL介导免疫“豁免”。正常情况下，眼睛是免疫豁免区，因病毒感染而进入前房的炎症细胞将通过Fas/FasL系统出现凋亡。

（3）Fas系统参与清除活化的淋巴细胞和病毒感染的细胞，而Fas和FasL功能丧失的突变可致淋巴细胞积聚，进而导致自身免疫疾病。

5、参与调节细胞凋亡的p53基因

（1）p53基因是肿瘤中突变频率最高的抑癌基因，研究表明它能引起细胞周期阻滞，诱导凋亡和促进细胞终末分化，因此和细胞凋亡存在密切关系。

（2）人类p53蛋白存在两种形式——野生型（wt p53）和突变型（mt p53），二者均调节细胞凋亡，但前者对细胞增殖、转化有抑制作用，故能促进凋亡，而后者可灭活前者的功能，抑制凋亡并导致细胞转化和过度增殖而产生肿瘤行为。

（3）p53基因产物p53蛋白是转录激活蛋白，作为“基因警卫”维持细胞基因的完整性、DNA损伤的修复以及细胞周期的正常运转。当p53基因缺失或异常时，p53失去监视作用，使细胞带着损伤的DNA进入S期，结果细胞因遗传不稳定性而产生突变或畸变，最后导致细胞癌变。

6、c-myc基因既是凋亡的激活因子又是抑制因素
c-myc基因可以产生两种翻译产物c-Myc1和c-Myc2，两者的作用不同，有时甚至是相反的。c-myc主要参与转录，在转录过程中可以激活并诱导细胞周期进程和分化，也可以阻止细胞分化或引起凋亡。

7、jun基因、c-fos基因、myb基因也与细胞凋亡有关

（二）细胞凋亡的信号转导通路主要由死亡受体和线粒体介导

  • 细胞凋亡的信号传导途径具有以下特点：

① 传导途径的启动可因细胞的种类、来源、生长环境和诱因的不同而存在差异；

② 凋亡信号传导系统具有多样性；

③ 细胞凋亡的信号途径与细胞增殖、分化的途径存在一些共同通路；

④ 凋亡的多条信号途径间存在互通的交叉部分。

1、死亡受体介导的信号转导通路：细胞外的许多信号分子可以与细胞表面相应的死亡受体结合，激活细胞凋亡信号通路，导致细胞凋亡。

（1）哺乳动物的死亡受体属于肿瘤坏死因子受体和神经生长因子受体超家族，主要成员由Fas/Apo-1/CD95、DR-4/TRAIL-R1、DR3/WSL-1/Apo-3/TRAMP等。

（2）配体FasL与死亡配体Fas结合后，诱导Fas胞质区内的死亡结构域结合Fas结合蛋白（FADD），FADD再以其氨基酸的死亡效应结构域结合caspase-8前体，形成Fas-FADD-caspase-8前体组成的死亡诱导复合物，激活caspase-8。

（3）活化的caspase-8可以进一步激活执行死亡功能的效应蛋白caspase-3，6，7等，导致细胞凋亡。

2、线粒体介导的信号转导通路

（1）线粒体在细胞凋亡中处于凋亡调控的重要位置，许多凋亡信号（如DNA损伤、氧化剂等）都可以引起线粒体的损伤和膜渗透性的改变。

（2）很多bcl-2家族的蛋白，如bcl-2、bax、bcl-XL等都定位于线粒体膜上，bcl-2通过阻止cyt C从线粒体释放来抑制凋亡；而bax则通过与线粒体上的膜通道结合，促使cyt C的释放而促进凋亡。

（3）此外，活化的caspase-8，一方面作用于caspase-3前体，另一方面催化BID（bcl-2家族的促凋亡分子）裂解成两个片段，其中含有BH3结构域的C-端片段被运送至线粒体，引起线粒体内cyt C高效释放。BID诱导cyt C释放的效率远高于bax。

3、其他转导通路

（1）内质网：内质网与细胞凋亡的联系主要表现在两个方面：

①内质网对Ca2+离子浓度的调控。内质网膜上的凋亡抑制蛋白Bcl-2具有维持胞质内Ca2+浓度稳定、抑制凋亡的作用。

②caspase在内质网的激活。胞质内Ca2+浓度的升高等因素可激活位于内质网膜上caspase-12，活化的caspase-12被转运到胞质中参与caspase-9介导的凋亡过程。

（2）溶酶体

五、细胞凋亡的检测

（一）形态学检测：鉴定细胞凋亡最可靠的方法之一，主要是通过光学显微镜和电子显微镜，对组织或细胞进行各种染色后观察。

（二）生化特征检测：细胞凋亡最显著的生化特征是Ca2+、Mg2+依赖的内源性核酸酶激活后，将细胞核染色体从核小体中断裂，形成约180~200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段。（琼脂糖凝胶电泳法、原位末端标记法、ELISA法等）

（三）流式细胞仪检测：既可定性又可以定量，且具有简单、快速和敏感性高等优点。

六、细胞凋亡与疾病

（一）细胞凋亡过低导致相关的疾病发生

1、细胞凋亡与肿瘤：人肿瘤细胞p53基因突变或缺失；高表达FasL（凋亡淋巴细胞）而又低表达Fas（降低自身凋亡）

2、细胞凋亡与系统性红斑狼疮（SLE）：Fas表达缺陷

（二）细胞凋亡过度导致相关的疾病发生

1、细胞凋亡与神经退行性疾病：阿尔兹海默症（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿舞蹈病、脊椎小脑失调等

2、细胞凋亡与AIDS病

3、细胞凋亡与心血管

第三节 细胞自噬

一、细胞自噬的定义和分类

（一）细胞自噬的定义

1、细胞自噬（名词解释）：细胞的自我消化，是胞质内大分子物质和细胞器在膜包裹泡中大量降解的生物学过程。

2、目前的研究认为，细胞自噬只发生在细胞进入周期后，静止期（G0期）细胞对自噬诱导因素不敏感。

（二）细胞自噬可区分为几种类型
（习题集三、5.）请解释根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，细胞自噬主要分为哪三种类型？
①微自噬：由溶酶体的膜直接包裹，如胞质中长寿蛋白在溶酶体内降解；
②巨自噬：即通常所指的自噬，是最普遍发生的由非溶酶体的膜（大多数学者认为是内质网膜）包裹胞质中可溶性蛋白和变性坏死的细胞器，形成自噬泡并与溶酶体融合进行消化降解。
③分子伴侣介导的自噬：由胞质中的分子伴侣Hsc73识别底物蛋白的特异氨基酸序列，并结合形成Hsc73-底物复合体，再结合溶酶体膜上受体蛋白，进入溶酶体腔被溶酶体酶消化降解，整个过程没有囊泡参与，对底物选择性清除。

二、细胞自噬的发生过程

（一）细胞自噬的发生过程

1、底物诱导自噬前体（PAS）的形成：在即将发生自噬的细胞胞质中会出现许多游离双层膜结构，成为自噬前体。

2、自噬体形成：自噬前体逐渐形成杯状凹陷，包裹细胞质或损伤/衰老的细胞器（如线粒体、内质网等），形成自噬体。

3、自噬体与溶酶体融合：自噬体形成后与溶酶体融合成自噬溶酶体

4、自噬体内容物被降解：在自噬溶酶体中，其内容物被水解酶重新降解成各自底物，如氨基酸、核苷酸等，供细胞重新吸收利用。

（二）细胞自噬的调控

1、正向调控：III型磷脂酰肌醇三磷酸激酶（Class III PI3K）、肿瘤抑制因子PTEN（为一磷酸酶）。

2、负向调控：mTOR信号途径

3、p53作为重要的肿瘤抑制因子在多种生理和病理状态下参与自噬反应的正、负向调控。

三、请简述细胞自噬的医学意义：

①自噬可以帮助细胞抵抗衰老、饥饿等外界压力，但过度的自噬又将导致细胞发生程序性死亡，被称为II型凋亡。

②自噬作用在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答能力极为关键，对防止某些疾病、抵御病原微生物感染和延缓衰老、延长寿命等方面发挥重要作用。