原理

多重荧光免疫组化技术(Multiplex immunohistochemical, mIHC) 亦称酪酰氨信号放大技术(Tyramide signal amplification, TSA)，是一种利用辣根过氧化酶(Horseradish Peroxidase, HRP)对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。其具体原理如下：

  • 标记与结合：利用辣根过氧化酶标记的二抗，结合已经通过一抗识别的目标蛋白。

  • 信号放大：辣根过氧化酶可以催化激活酪胺衍生荧光染料，后者激活后能与抗原上的酪氨酸残基发生共价结合。

  • 清洗非共价结合物：通过热处理或微波处理，可洗脱一抗和二抗并同时保留与组织抗原共价结合的荧光素。在清洗过程中，未与抗原上酪氨酸残基发生共价结合的酪胺衍生荧光染料也被移除，而共价结合的荧光素仍然保留在样本上。

  • 多轮染色：更换不同的一抗和荧光染料，重复上述步骤，以实现多个目标蛋白的同时检测。

  • 最终检测：经过多轮染色后，组织或细胞样本上会结合多种荧光染料，可以通过荧光显微镜进行观察分析。

特点

  • 荧光放大信号强，约为普通荧光的3~10倍。

  • 由于每一轮染色后，上一轮的一抗和二抗均被移除，上一轮的抗体不会对下一轮的染色产生影响，因此一抗抗体种属来源不限。

  • 荧光素稳定不易淬灭，故无需严格避光。