参考文章：
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聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR） 是一种利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，在体外由引物介导的酶促反应合成特异DNA片段的技术。

普通PCR技术

普通PCR技术即第一代PCR技术，以双链DNA为模板、dNTPs为底物进行扩增，随后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。

PCR反应体系

PCR反应体系包括模板、引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg²⁺等。

引物是指与待扩增DNA片段两端序列互补的短单链DNA，通常为18-24个核苷酸（18-24 nt），包括上游引物（FP）和下游引物（RP）两种，决定了扩增的DNA序列片段及长度。

Taq DNA聚合酶是从嗜热菌分离的耐热聚合酶，在95℃高温不失活；而Mg²⁺为其辅因子。PCR发明初期所使用的Klenow片段、T4 DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶因对热的稳定性差而未得到广泛应用，直至该酶的发现才使PCR技术实现自动化并迅速发展。Taq DNA聚合酶的发现者Kary Mullis也因此获得了1993年诺贝尔奖。

dNTPs为PCR反应提供DNA合成的原料和能量。需要注意：①dNTPs浓度大于50 mmol/L时，Taq DNA聚合酶的活性会受到抑制；②PCR反应体系中四种dNTP的浓度应保持相等，避免因某种dNTP的浓度不足而导致错误的掺入。

PCR反应程序

PCR循环主要包括以下几大步骤。

预变性

在循环开始前，将样本在94-98℃下处理3-5分钟，使得所有双联的DNA模板彻底、均匀地解链为单链。

PCR循环

PCR循环包括变性、退火和延伸三大步骤，一般重复30-40个循环。在PCR循环中，模板DNA的拷贝数呈指数级增长，这是PCR灵敏度高的主要原因。

  • 变性： 在94-95℃下处理15-30s，充分断裂碱基对中的氢键，使得双链DNA解链为两条单链模板。
  • 退火： 在Tm值±3℃处理15-30s（通常为55-65℃），使得单链DNA模板与引物结合形成引物-模板复合物。
  • 延伸： 在DNA聚合酶的最适温度下（Taq酶的最适温度为72℃）处理15-30s/kb。在此过程中，Taq DNA聚合酶以dNTPs为原料，沿5’→3’端合成新的DNA互补链。其合成产物又将成为下一轮循环的DNA模板。

终延伸

在DNA聚合酶最适温度下处理5-10min，确保所有未完成的延伸产物合成全长，避免短片段残留对分析造成影响。

保存

通常在4℃下进行保存，防止产物降解，便于电泳或保存。

实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR, qPCR） 即第二代PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光报告基团，利用荧光信号的实时积累监测整个PCR过程，通过扩增曲线对起始模板量进行精确定量的技术。

qPCR反应体系

qPCR反应体系在传统PCR反应体系的基础上加入了荧光染料或荧光基团，荧光化学方法主要包括以下两大类。

其一是 SYBR Green染料法 。该染料可以嵌入双链DNA的小沟，结合后可以发出荧光信号；而游离状态的燃料则不发出荧光。其成本低廉、通用性强、灵敏度高，但其与引物二聚体和非特异扩增DNA片段结合也能产生信号，这导致其特异性不高，易产生“假阳性”结果。因此，需要结合熔解曲线验证扩增产物的特异性。

熔解曲线：扩增长度后缓慢升温并连续采集荧光，产物应呈锐利单峰；双峰提示存在引物二聚体或非特异扩增。

其二是 TaqMan探针法 。该探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭集基团。未结合DNA片段时，探针中的荧光基团因淬灭集团的存在而无法发出荧光；而在扩增时，探针结合至DNA模板上，在延伸阶段，Taq酶凭借其5’→3’外切酶活性水解探针，使荧光基团和淬灭基团分离而发出荧光。这种方法特异性强、灵敏度高，适合多重qPCR检测，但因探针需特别定制，成本较高；且探针水解易受酶性能和试剂的影响；淬灭难以彻底；检测结果很难判断实际的扩增特性。

qPCR扩增曲线与Ct值

qPCR扩增曲线呈S型，可分为基线期、指数期和平台期。其中，在指数期期间，产物每经过一次循环，即以接近200%的效率增长，是最佳定量分析区间。

阈值周期/阈值循环（Cycle threshold, Ct） 是指扩增反应中，荧光信号首次超过设定阈值时所对应的循环数。显而易见，起始DNA模板拷贝多，荧光超过阈值的速度越快，Ct值则越小。在PCR实验体系中，模板量每相差10倍，Ct值约相差3.3个循环，这是qPCR定量的数字基础。

定量方法

qPCR的定量方法有标准曲线法和2-ΔΔCt法（Livak法）。

标准曲线法是指将已知拷贝数的标准品进行系列梯度稀释并同步扩增，以Ct值对log（拷贝数）绘制标准曲线，再将未知样本的Ct值代入求得绝对拷贝数。

2-ΔΔCt法使用如下计算步骤对拷贝数进行相对定量：ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)，ΔΔCt=ΔCt(处理组)-ΔCt(对照组)，相对表达倍数=2-ΔΔCt。

与普通PCR技术相比，qPCR在指数期采集荧光信号，此时产物量与起始模板量保持严格的对数线性关系，克服了终点法无法定量分析的缺陷。

逆转录PCR技术

在PCR和qPCR步骤的基础上，加入将mRNA或总RNA转录为cDNA的前置步骤，即为逆转录PCR（Reserve transcription-PCR, RT-PCR）和实时荧光定量逆转录PCR技术（RT-qPCR），通过该技术可对RNA进行扩增及定性（RT-PCR）或定量（RT-qPCR）分析。

需要注意的是，我们提到的RT-PCR一般指Reserve transcription-PCR即逆转录PCR，而非Real-time PCR即实时荧光定量PCR，后者一般缩写为qPCR。